Vloeistofchromatografie is die hoofmetode om die inhoud van elke komponent en onsuiwerhede in grondstowwe, tussenprodukte, preparate en verpakkingsmateriaal te toets, maar baie stowwe het nie standaardmetodes om op staat te maak nie, dus is dit onvermydelik om nuwe metodes te ontwikkel. In die ontwikkeling van vloeistoffasemetodes is die chromatografiese kolom die kern van vloeistofchromatografie, so hoe om 'n geskikte chromatografiese kolom te kies, is van kardinale belang. In hierdie artikel sal die skrywer verduidelik hoe om 'n vloeistofchromatografiekolom uit drie aspekte te kies: algehele idees, oorwegings en toepassingsomvang.
A. Algehele idees vir die keuse van vloeistofchromatografiekolomme
1. Evalueer die fisiese en chemiese eienskappe van die analiet: soos chemiese struktuur, oplosbaarheid, stabiliteit (soos of dit maklik is om geoksideer/verminder/gehidroliseer te word), suurheid en alkaliniteit, ens., veral die chemiese struktuur is die sleutel faktor in die bepaling van die eienskappe, soos die gekonjugeerde groep het sterk ultraviolet absorpsie en sterk fluoressensie;
2. Bepaal die doel van analise: of hoë skeiding, hoë kolomdoeltreffendheid, kort ontledingstyd, hoë sensitiwiteit, hoëdrukweerstand, lang kolomlewe, lae koste, ens. vereis word;
- Kies 'n geskikte chromatografiese kolom: verstaan die samestelling, fisiese en chemiese eienskappe van die chromatografiese vuller, soos die deeltjiegrootte, porieëgrootte, temperatuurverdraagsaamheid, pH-toleransie, adsorpsie van die analiet, ens.
- Oorwegings vir die keuse van vloeistofchromatografiekolomme
Hierdie hoofstuk sal die faktore bespreek wat oorweeg moet word wanneer 'n chromatografiekolom gekies word vanuit die perspektief van die fisiese en chemiese eienskappe van die chromatografiekolom self. 2.1 Vulmatriks
2.1.1 Silikagelmatriks Die vulmatriks van die meeste vloeistofchromatografiekolomme is silikagel. Hierdie tipe vuller het hoë suiwerheid, lae koste, hoë meganiese sterkte en is maklik om groepe te verander (soos fenielbinding, aminobinding, sianobinding, ens.), maar die pH-waarde en temperatuurreeks wat dit verdra is beperk: die pH-reeks van die meeste silikagel-matriksvullers is 2 tot 8, maar die pH-reeks van spesiaal gemodifiseerde silikagel-gebonde fases kan so wyd as 1,5 tot 10 wees, en daar is ook spesiaal gemodifiseerde silikagel-gebonde fases wat stabiel is by lae pH, soos Agilent ZORBAX RRHD stablebond-C18, wat stabiel is by pH 1 tot 8; die boonste temperatuurlimiet van die silikagelmatriks is gewoonlik 60 ℃, en sommige chromatografiekolomme kan 'n temperatuur van 40 ℃ by hoë pH verdra.
2.1.2 Polimeermatriks Polimeervullers is meestal polistireen-divinielbenseen of polimetakrilaat. Hulle voordele is dat hulle 'n wye pH-reeks kan verdra – hulle kan in die reeks van 1 tot 14 gebruik word, en hulle is meer bestand teen hoë temperature (kan bo 80 °C bereik). In vergelyking met silika-gebaseerde C18-vullers, het hierdie tipe vuller sterker hidrofobisiteit, en die makroporeuse polimeer is baie effektief om monsters soos proteïene te skei. Die nadele daarvan is dat die kolomdoeltreffendheid laer is en die meganiese sterkte swakker is as dié van silika-gebaseerde vullers. 2.2 Deeltjievorm
Die meeste moderne HPLC-vullers is sferiese deeltjies, maar soms is dit onreëlmatige deeltjies. Sferiese deeltjies kan laer kolomdruk, hoër kolomdoeltreffendheid, stabiliteit en langer lewe verskaf; wanneer hoëviskositeit mobiele fases (soos fosforsuur) gebruik word of wanneer die monsteroplossing viskeus is, het onreëlmatige deeltjies 'n groter spesifieke oppervlakte, wat meer bevorderlik is vir die volle werking van die twee fases, en die prys is relatief laag. 2.3 Deeltjiegrootte
Hoe kleiner die deeltjiegrootte, hoe hoër is die kolomdoeltreffendheid en hoe hoër die skeiding, maar hoe slegter is die hoëdrukweerstand. Die mees algemeen gebruikte kolom is die 5 μm deeltjiegrootte kolom; indien die skeidingsvereiste hoog is, kan 'n 1.5-3 μm vulstof gekies word, wat bevorderlik is om die skeidingsprobleem van sommige komplekse matriks- en multikomponentmonsters op te los. UPLC kan 1,5 μm vullers gebruik; 10 μm of groter deeltjiegrootte vullers word dikwels gebruik vir semi-voorbereidende of voorbereidende kolomme. 2.4 Koolstofinhoud
Koolstofinhoud verwys na die verhouding van gebonde fase op die oppervlak van silikagel, wat verband hou met spesifieke oppervlakarea en gebonde fasebedekking. Hoë koolstofinhoud verskaf hoë kolomkapasiteit en hoë resolusie, en word dikwels gebruik vir komplekse monsters wat hoë skeiding vereis, maar as gevolg van die lang interaksietyd tussen die twee fases is die ontledingstyd lank; lae koolstofinhoud chromatografiese kolomme het 'n korter analise tyd en kan verskillende selektiwiteite toon, en word dikwels gebruik vir eenvoudige monsters wat vinnige analise vereis en monsters wat hoë waterfase toestande vereis. Oor die algemeen wissel die koolstofinhoud van C18 van 7% tot 19%. 2.5 Poriegrootte en spesifieke oppervlakte
HPLC adsorpsie media is poreuse deeltjies, en die meeste interaksies vind in die porieë plaas. Daarom moet molekules die porieë binnegaan om geadsorbeer en geskei te word.
Poriegrootte en spesifieke oppervlakte is twee komplementêre konsepte. Klein poriegrootte beteken groot spesifieke oppervlakte, en omgekeerd. 'n Groot spesifieke oppervlakte kan die interaksie tussen monstermolekules en gebonde fases verhoog, retensie verbeter, monsterlading en kolomkapasiteit verhoog, en skeiding van komplekse komponente. Ten volle poreuse vullers behoort tot hierdie tipe vullers. Vir diegene met hoë skeidingsvereistes word dit aanbeveel om vullers met 'n groot spesifieke oppervlak te kies; klein spesifieke oppervlakte kan terugdruk verminder, kolomdoeltreffendheid verbeter en ewewigstyd verminder, wat geskik is vir gradiëntanalise. Kern-dopvullers behoort tot hierdie tipe vullers. Op die uitgangspunt om skeiding te verseker, word dit aanbeveel om vullers met 'n klein spesifieke oppervlak te kies vir diegene met hoë vereistes vir ontledingsdoeltreffendheid. 2.6 Porievolume en meganiese sterkte
Porievolume, ook bekend as "porievolume", verwys na die grootte van die leemtevolume per eenheiddeeltjie. Dit kan die meganiese sterkte van die vuller goed weerspieël. Die meganiese sterkte van vullers met groot porievolume is effens swakker as dié van vullers met klein porievolume. Vullers met porievolume minder as of gelyk aan 1.5 mL/g word meestal vir HPLC-skeiding gebruik, terwyl vullers met porievolume groter as 1.5 mL/g hoofsaaklik vir molekulêre uitsluitingschromatografie en laedrukchromatografie gebruik word. 2.7 Beperkingskoers
Afdekking kan die stertpieke wat veroorsaak word deur die interaksie tussen verbindings en blootgestelde silanolgroepe (soos ioniese binding tussen alkaliese verbindings en silanolgroepe, van der Waals-kragte en waterstofbindings tussen suurverbindings en silanolgroepe) verminder, waardeur kolomdoeltreffendheid en piekvorm verbeter word . Ongekapte gebonde fases sal verskillende selektiwiteite produseer relatief tot gekapte gebonde fases, veral vir polêre monsters.
- Toepassingsomvang van verskillende vloeistofchromatografiekolomme
Hierdie hoofstuk sal die toepassingsomvang van verskillende tipes vloeistofchromatografiekolomme deur sommige gevalle beskryf.
3.1 Omgekeerde-fase C18 chromatografiese kolom
Die C18-kolom is die mees gebruikte omgekeerde-fase-kolom, wat kan voldoen aan die inhoud- en onsuiwerheidstoetse van die meeste organiese stowwe, en is van toepassing op medium-polêre, swak polêre en nie-polêre stowwe. Die tipe en spesifikasie van C18 chromatografiese kolom moet gekies word volgens die spesifieke skeidingsvereistes. Byvoorbeeld, vir stowwe met hoë skeidingsvereistes word 5 μm*4.6 mm*250 mm spesifikasies dikwels gebruik; vir stowwe met komplekse skeidingsmatrikse en soortgelyke polariteit, kan 4 μm*4.6 mm*250 mm spesifikasies of kleiner deeltjiegroottes gebruik word. Die skrywer het byvoorbeeld 'n 3 μm*4.6 mm*250 mm kolom gebruik om twee genotoksiese onsuiwerhede in celecoxib API op te spoor. Die skeiding van die twee stowwe kan 2,9 bereik, wat uitstekend is. Daarbenewens word 'n kort kolom van 10 mm of 15 mm dikwels gekies, onder die uitgangspunt om skeiding te verseker, indien vinnige ontleding vereis word. Byvoorbeeld, wanneer die skrywer LC-MS/MS gebruik het om 'n genotoksiese onsuiwerheid in piperaquine fosfaat API op te spoor, is 'n 3 μm*2.1 mm*100 mm kolom gebruik. Die skeiding tussen die onsuiwerheid en die hoofkomponent was 2.0, en die opsporing van 'n monster kan binne 5 minute voltooi word. 3.2 Omgekeerde-fase fenielkolom
Fenielkolom is ook 'n tipe omgekeerde-fasekolom. Hierdie tipe kolom het sterk selektiwiteit vir aromatiese verbindings. As die reaksie van aromatiese verbindings gemeet deur gewone C18-kolom swak is, kan jy dit oorweeg om die fenielkolom te vervang. Byvoorbeeld, toe ek celecoxib API gemaak het, was die hoofkomponent-reaksie gemeet deur die fenielkolom van dieselfde vervaardiger en dieselfde spesifikasie (almal 5 μm*4.6 mm*250 mm) ongeveer 7 keer dié van die C18-kolom. 3.3 Normale-fase kolom
As 'n effektiewe aanvulling tot omgekeerde-fase kolom, is normale-fase kolom geskik vir hoogs polêre verbindings. As die piek nog baie vinnig is wanneer geëlueer word met meer as 90% waterfase in die omgekeerde-fase kolom, en selfs naby en oorvleuel met die oplosmiddel piek, kan jy oorweeg om die normale-fase kolom te vervang. Hierdie tipe kolom sluit hilic kolom, amino kolom, siano kolom, ens.
3.3.1 Hiliese kolom Hiliese kolom sluit gewoonlik hidrofiele groepe in die gebonde alkielketting in om die reaksie op polêre stowwe te verbeter. Hierdie tipe kolom is geskik vir die ontleding van suikerstowwe. Die skrywer het hierdie tipe kolom gebruik wanneer die inhoud en verwante stowwe van xilose en sy afgeleides gedoen is. Die isomere van 'n xilose-derivaat kan ook goed geskei word;
3.3.2 Aminokolom en sianokolom Aminokolom en sianokolom verwys na die bekendstelling van amino- en sianomodifikasies aan die einde van die gebonde alkielketting, onderskeidelik, om die selektiwiteit vir spesiale stowwe te verbeter: byvoorbeeld, aminokolom is 'n goeie keuse vir die skeiding van suikers, aminosure, basisse en amiede; sianokolom het beter selektiwiteit wanneer gehidrogeneerde en ongehidrogeneerde strukturele soortgelyke stowwe geskei word as gevolg van die teenwoordigheid van gekonjugeerde bindings. Aminokolom en sianokolom kan dikwels tussen normale fasekolom en omgekeerde fasekolom omgeskakel word, maar gereelde omskakeling word nie aanbeveel nie. 3.4 Chirale kolom
Chirale kolom, soos die naam aandui, is geskik vir die skeiding en ontleding van chirale verbindings, veral in die veld van farmaseutiese produkte. Hierdie tipe kolom kan oorweeg word wanneer konvensionele omgekeerde fase en normale fase kolomme nie die skeiding van isomere kan bereik nie. Die skrywer het byvoorbeeld 'n 5 μm*4.6 mm*250 mm chirale kolom gebruik om die twee isomere van 1,2-difenieletileendiamien te skei: (1S, 2S)-1, 2-difenieletileendiamien en (1R, 2R)-1, 2 -difenieletileendiamien, en die skeiding tussen die twee het ongeveer 2,0 bereik. Chirale kolomme is egter duurder as ander tipes kolomme, gewoonlik 1W+/stuk. Indien daar 'n behoefte aan sulke kolomme is, moet die eenheid 'n voldoende begroting maak. 3.5 Ioonuitruilkolom
Ioonuitruilkolomme is geskik vir die skeiding en ontleding van gelaaide ione, soos ione, proteïene, nukleïensure en sommige suikerstowwe. Volgens die tipe vulstof word hulle verdeel in katioonuitruilkolomme, anioonuitruilkolomme en sterk katioonuitruilkolomme.
Katioonuitruilkolomme sluit kalsiumgebaseerde en waterstofgebaseerde kolomme in, wat hoofsaaklik geskik is vir die ontleding van kationiese stowwe soos aminosure. Die skrywer het byvoorbeeld kalsiumgebaseerde kolomme gebruik wanneer kalsiumglukonaat en kalsiumasetaat in 'n spoeloplossing ontleed is. Beide stowwe het sterk reaksies gehad by λ=210nm, en die skeidingsgraad het 3.0 bereik; die skrywer het waterstofgebaseerde kolomme gebruik wanneer glukoseverwante stowwe ontleed is. Verskeie hoofverwante stowwe – maltose, maltotriose en fruktose – het hoë sensitiwiteit onder differensiële detektors gehad, met 'n opsporingslimiet so laag as 0,5 dpm en 'n skeidingsgraad van 2,0-2,5.
Anioonuitruilkolomme is hoofsaaklik geskik vir die ontleding van anioniese stowwe soos organiese sure en halogeenione; sterk katioonuitruilkolomme het hoër ioonuitruilvermoë en selektiwiteit, en is geskik vir die skeiding en ontleding van komplekse monsters.
Bogenoemde is slegs 'n inleiding tot die tipes en toepassingsreekse van verskeie algemene vloeistofchromatografiekolomme gekombineer met die skrywer se eie ervaring. Daar is ander spesiale tipes chromatografiese kolomme in werklike toepassings, soos groot-porie chromatografiese kolomme, klein-porie chromatografiese kolomme, affiniteit chromatografie kolomme, multimodus chromatografiese kolomme, ultra-hoë werkverrigting vloeistof chromatografie kolomme (UHPLC), superkritiese vloeistof chromatografie kolomme ( SFC), ens. Hulle speel 'n belangrike rol in verskillende velde. Die spesifieke tipe chromatografiese kolom moet gekies word volgens die struktuur en eienskappe van die monster, skeidingsvereistes en ander doeleindes.
Pos tyd: Jun-14-2024